利用高光譜成像技術(shù)對紅辣椒根腐病的檢測與分析

背景：中國是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，農(nóng)業(yè)在國民經(jīng)濟(jì)的組成和發(fā)展中的地位至關(guān)重要。蔬菜種植是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)種植業(yè)的重要分支，是農(nóng)民重要的收入來源之一。自從中國加入WTO之后，中國的蔬菜生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)在國際上具有更大的競爭優(yōu)勢。辣椒作為產(chǎn)業(yè)鏈最為完整的蔬菜品類，在我國有400多年的種植歷史，因其能夠分泌辣椒素而味辣，維生素C占蔬菜首位，從而在我國調(diào)味品種占有重要位置。近年來，我國辣椒種植規(guī)模不斷增長，產(chǎn)量不斷上升，辣椒種植面積約220萬hm2，產(chǎn)值達(dá)2500億元，占全國蔬菜總值的11.36%，辣椒產(chǎn)業(yè)對農(nóng)民收入貢獻(xiàn)率達(dá)到1.14%。近年來，受新冠肺炎疫情、水澇、干旱等自然災(zāi)害以及病蟲害影響導(dǎo)致辣椒單產(chǎn)下降，利潤率下降。其中由于栽培模式固定、重茬面積大、管理粗放、抗御旱澇災(zāi)害的能力不強(qiáng)，使得辣椒根腐病在各個(gè)地區(qū)呈現(xiàn)逐年加重趨勢，造成辣椒減產(chǎn)或絕產(chǎn)，嚴(yán)重制約著辣椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，給農(nóng)戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。辣椒根腐病是典型的土傳病害，可以引起辣椒根系和近地面莖稈木質(zhì)部、韌皮部壞死，導(dǎo)致辣椒不能輸送水分和營養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)病后地下部分根系和莖稈全部壞死，地上部干枯死亡。該病害在我國各辣椒產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，已報(bào)道的辣椒根腐病致病菌有鐮孢屬、疫霉屬和腐霉屬等，其中鐮孢菌是引起辣椒根腐病的主要病原菌，病原菌以厚垣孢子、菌核或菌絲體在土壤中越冬，成為翌年主要初侵染源，病菌從根莖部或根部傷口侵入，通過雨水或灌溉水傳播和蔓延。因此，由鐮孢菌引起辣椒根腐病發(fā)生周期長，在幼苗期到成株期均能發(fā)生，導(dǎo)致辣椒減產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。辣椒根腐病具有極強(qiáng)的隱蔽性，發(fā)病前期肉眼難以發(fā)現(xiàn)。對于辣椒根腐病等土壤傳播的病害治理，一般的預(yù)防方法為定期檢查致病病原體在土壤中的分布和控制土壤中病原體的密度，并通過生物和化學(xué)控制劑來阻斷其傳播。其中定期檢查需要耗費(fèi)治理人員大量時(shí)間且對治理人員的專業(yè)要求較高。因此，開發(fā)一種能夠通過辣椒植株的地上部分（葉或莖）在未顯現(xiàn)癥狀的情況下檢測出辣椒根腐病的方法（新思路）是辣椒種植農(nóng)戶的迫切需求，對辣椒種植和育種產(chǎn)業(yè)有重要意義。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：樣品制備于2022年12月在山東省濟(jì)寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)院的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。為了擴(kuò)大樣本容量和提高模型的容錯(cuò)率，方便將模型移植到其他辣椒品種中。試驗(yàn)選取兩種辣椒品種（山椒4號和滿山紅）種子進(jìn)行幼苗培育。辣椒幼苗的培養(yǎng)步驟具體如下：將攝氏溫度55°的溫水倒入放好種子的燒杯中，使用玻璃棒連續(xù)攪拌10 min;倒掉燒杯中的溫水，將種子沖洗兩次后浸種8~10h;將種子均勻放在濕毛巾上（保持濕潤），將濕毛巾放在托盤中，將托盤放置在光照培養(yǎng)箱下催芽（一般四天出芽）；將發(fā)芽種子轉(zhuǎn)移到含育苗基質(zhì)（珍珠巖、多菌靈和有機(jī)營養(yǎng)土等）的育苗杯中，并放回光照培養(yǎng)箱下培養(yǎng)17天，每個(gè)育苗杯中成活1~3株。光照培養(yǎng)箱的條件設(shè)置為：亮光環(huán)境培養(yǎng)時(shí)間為10h，溫度=28°，濕度=60%，光照強(qiáng)度為4500~10000Lux；暗環(huán)境培養(yǎng)時(shí)間為14h，溫度=23°，濕度=60%。

通過人工接種的方式使辣椒幼苗感染根腐病病菌，接種步驟符合中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) （NT/T2060 1-2011）。試驗(yàn)所用根腐病病菌原液由濟(jì)寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)院培養(yǎng)和提供，使用灌根接種法接種根腐病病原菌。具體做法是：從兩個(gè)品種中分別挑選20株長勢一致、健康的辣椒幼苗進(jìn)行病菌接種；接種前澆灌幼苗以保持土壤濕潤，使用玻璃棒在辣椒幼苗莖基部附近扎一個(gè)小穴；使用移液槍將5ml孢子懸浮液（濃度為103個(gè)游動(dòng)孢子/ml）注入穴內(nèi)。接種后，將辣椒幼苗放回光照培養(yǎng)箱，更改亮光環(huán)境培養(yǎng)時(shí)間為12h，暗環(huán)境培養(yǎng)時(shí)間為12h，其他條件不變。

在實(shí)驗(yàn)過程中，接種辣椒幼苗發(fā)病明顯。在接種病菌第一天肉眼無法觀察出癥狀。接種后第二天，兩個(gè)品種的辣椒幼苗都陸續(xù)出現(xiàn)根腐病的典型癥狀，具體表現(xiàn)為葉片萎蔫且莖基部收縮，莖部輕微倒伏。在接種第三天，辣椒幼苗的葉片萎縮嚴(yán)重且莖基部呈暗褐色，造成幼苗折倒枯死。將辣椒葉片樣本分為三個(gè)階段，接種病菌前作為健康期（0d），接種病菌第一天作為潛伏期（1d），接種病菌第二天作為發(fā)病期（2d）。

這個(gè)試驗(yàn)使用GaiaField-V10E便攜式可見光/近紅外成像系統(tǒng)（Jiangsu Dualix Spec­tral Imaging Technology Co., Ltd, Wuxi, Jiangsu, China）采集高光譜圖像信息。該系統(tǒng)包括光譜儀（GaiaField-V10E）、成像鏡頭（HSIA-OL23）、專用光源（HSIA-LS-T-200 W）、標(biāo)準(zhǔn)白板（HSIA-CT-150 × 150）和專用電腦（(Surface Go 2 4425Y, Microsoft., USA）等組件。該設(shè)備可以在可見光和近紅外波段范圍內(nèi)進(jìn)行成像，波長覆蓋范圍為400~1000nm，光譜分辨率為2.8nm，每個(gè)樣本可獲取696×697×256波段的高光譜圖像立方體，曝光時(shí)間設(shè)置為12毫秒，入射狹縫寬度為30微米，視場角為22°，CCD像素為1392*1040。

接種根腐病病菌的辣椒植株為各品種20株，共40株可用辣椒植株。從每一株植株中選取葉片最大,葉脈清晰的兩片葉子作為研究對象，共標(biāo)記了80篇葉片。連續(xù)在健康期、潛伏期和患病期對辣椒植株進(jìn)行高光譜圖像拍攝。將所有辣椒葉片樣本按2:1的比例使用SPXY算法劃分訓(xùn)練集與預(yù)測集，以建立適用范圍更加廣泛的辣椒根腐病早期診斷模型。結(jié)果為總樣本集辣椒葉片數(shù)據(jù)240個(gè)，其中總訓(xùn)練集辣椒葉片數(shù)據(jù)162個(gè)，總預(yù)測集數(shù)據(jù)78個(gè)。其中健康期、潛伏期和發(fā)病期總樣本數(shù)均為80個(gè)，訓(xùn)練集均為54個(gè)，預(yù)測集均為26個(gè)。

使用SPA和光譜指數(shù)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)降維，使用PLS-DA,LSSVM,BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等技術(shù)進(jìn)行病害早期預(yù)測。

結(jié)論：圖1為辣椒在400 ~ 1000 nm范圍內(nèi)的平均光譜標(biāo)準(zhǔn)差曲線及其對應(yīng)的葉片狀態(tài)的圖片。結(jié)果表明兩類辣椒品種樣品的光譜曲線趨勢差異很小，差異主要集中在550-650和750-850的波長區(qū)間內(nèi)。550-650的波長區(qū)間內(nèi)的光譜信息通常用于表征植被特征如植被的生長情況和健康狀況等，可以用于衡量葉綠素的含量。山椒4號的患病期樣本的光譜反射率下降趨勢更加明顯，表征患病期樣本和其他樣本差異性大，可能在受根腐病脅迫時(shí)失去了更多的葉綠素。在750-850的波段區(qū)間內(nèi)，滿山紅的潛伏期葉片樣本的反射率有從低到高增加的趨勢，潛伏期樣本和健康期樣本的光譜反射率差異大，和患病期樣本的差異小，可能是潛伏期失水較多，使這一品種的辣椒的健康期葉片和潛伏期葉片差別較大。山椒4號的潛伏期葉片樣本的光譜反射率則更加平緩?？傮w而言，兩個(gè)品種的辣椒光譜曲線趨勢基本相似，所以這個(gè)論文把兩類辣椒品種合并在一起進(jìn)行建模研究。這樣做，能增加病害早期檢測模型的可移植性，使這個(gè)研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以應(yīng)用到其他辣椒品種中。觀察圖2不難發(fā)現(xiàn)健康辣椒葉片和染病辣椒葉片在550nm、580~680 nm和760~1000nm波長范圍內(nèi)的光譜反射率有明顯的區(qū)別。這種顯著性的差異證實(shí)了高光譜成像技術(shù)在識別葉片病變方面的有效性（10）。進(jìn)一步分析表明，健康期辣椒葉片反射率最高，發(fā)病期的辣椒葉片的光譜反射率明顯低于潛伏期辣椒葉片的光譜反射率。在580~680nm范圍內(nèi)，健康期葉片的反射率較低，而且隨著患病程度的加重，該范圍內(nèi)的反射率逐漸減小。染?。ò摲诤桶l(fā)病期）的葉片在近紅外波段的光譜反射率明顯低于健康葉片的反射率，且隨著辣椒葉片患病程度的加深，近紅外波段范圍內(nèi)的反射率逐漸減小，這是由于病菌引起根莖細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞而導(dǎo)致的葉片含水量和葉綠素含量下降造成的。

利用SPA從全光譜數(shù)據(jù)中挑選出*有效的特征波長，減少冗余變量。如圖3（a）所示，設(shè)置特征波段數(shù)量范圍為10至32個(gè)，經(jīng)過反復(fù)測試，當(dāng)變量個(gè)數(shù)為13時(shí)，使用的特征波長組合具有最小的校正均方根誤差（RMSE=0.2797）。最終篩選出的特征波段為：425、433、437、453、552、639、670、680、690、715、741、819、909nm，占全部波段的5.08%。

將所有辣椒樣本按健康期、潛伏期和發(fā)病期三類進(jìn)行賦值分類，將辣椒葉片樣本在400nm到1000nm任意兩波段下反射率計(jì)算出的NDSI值，利用皮爾森算法（Pearson correlation coefficient）與其對應(yīng)的染病階段進(jìn)行相關(guān)性分析，將相關(guān)系數(shù)繪制成分布矩陣，如圖4所示。

紅色區(qū)域顯示最高正相關(guān)值，藍(lán)色區(qū)域顯示最高負(fù)相關(guān)值。560~610nm及附近波長范圍構(gòu)建出的光譜指數(shù)與根腐病顯示出極高的相關(guān)性。790~810nm及附近波長范圍構(gòu)建出的光譜指數(shù)與根腐病具有較高的相關(guān)性，該區(qū)域相關(guān)系數(shù)絕對值明顯低于560~610nm波段區(qū)域，相關(guān)系數(shù)絕對值（|r|）最高值為0.725。其他區(qū)域構(gòu)建出的光譜指數(shù)與根腐病的相關(guān)性普遍較低，|r|范圍區(qū)間在0到0.3。結(jié)果表明，與辣椒根腐病相關(guān)的敏感波段主要分布在560~610nm與560~610nm這個(gè)波段區(qū)域。

在高光譜分類中，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)得到了最高的準(zhǔn)確率。整個(gè)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型由input，hidden layer、output layer和output組成，其中hidden layer的激活函數(shù)設(shè)置為tansig，output layer 的激活函數(shù)設(shè)置為purelin。將訓(xùn)練參數(shù)中的最大迭代次數(shù)設(shè)置為10000，目標(biāo)訓(xùn)練誤差設(shè)置為10-6，學(xué)習(xí)率設(shè)置為0.01。整個(gè)BP網(wǎng)絡(luò)使用levenberg-marquardt訓(xùn)練算法，validation checks設(shè)置為6，數(shù)據(jù)分類方式設(shè)置為random。最后經(jīng)過多次調(diào)試，得出了模型的預(yù)測集訓(xùn)練結(jié)果如圖5所示。

具體的訓(xùn)練結(jié)果在混淆矩陣圖6所示，圖6（a）是SPA的分類結(jié)果，其中29個(gè)健康樣本有3個(gè)被誤判為潛伏期，28個(gè)潛伏期樣本有2個(gè)被誤判為健康期，21個(gè)患病期樣本被誤判為潛伏期樣本。圖6（b）是光譜指數(shù)的分類結(jié)果，其中27個(gè)健康樣本有2個(gè)被誤判為潛伏期，29個(gè)潛伏期樣本有5個(gè)被誤判為健康期，有1個(gè)被誤判為患病期。潛伏期和健康期葉片之間的誤判大部分是山椒4號品種的辣椒，誤判數(shù)為5個(gè)（共7個(gè)），僅僅有兩個(gè)是滿山紅品種的辣椒，或許滿山紅辣椒的潛伏期和健康期的差別比山椒4號更大一些

圖6